DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學(xué)降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今 dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實(shí)驗室中使用*多的一種型號。 1．a(chǎn)bi prism 310基因分析儀是**精密儀器，需專人操作、管理和維護(hù)。
2．本實(shí)驗測序pcr反應(yīng)的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以pcr管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊pcr管蓋外，*好選用pe公司的pcr管。如pcr結(jié)束后pcr液小于4～4.5μl，則此pcr反應(yīng)可能失敗，不必進(jìn)行純化和上樣。
3．作為測序用戶來說，只需提供純化好的dna樣品和引物，一個測序pcr反應(yīng)使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr測序所需模板的量較少，一般pcr產(chǎn)物需30～90ng，單鏈dna需50～100ng，雙鏈dna需200～500ng，dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6～2.0，*好用去離子水或三蒸水溶解dna，不用te緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實(shí)驗使用的測序試劑盒是bigdye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測dna長度為650bp左右。本儀器dna測序**度為 (98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基n<2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設(shè)計另外的引物。為保證測序更為準(zhǔn)確，可設(shè)計反向引物對同一模板進(jìn)行測序，相互印證。對于n堿基可進(jìn)行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的**度，根據(jù)星號提示位置，可人工分析該處彩**譜，對該處堿基作進(jìn)一步核對。
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